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　　細(xì)胞介紹

　　1997從一位不受激素影響的前列腺癌患者脊椎轉(zhuǎn)移灶中建立了這株細(xì)胞。先在小鼠中進(jìn)行異種移植傳代，隨后進(jìn)行體外培養(yǎng)。體內(nèi)及體外都對雄性激素敏感。

　　細(xì)胞特性

　　1）來源：前列腺癌

　　2）形態(tài)：上皮細(xì)胞樣貼壁生長

　　3）含量：1x106細(xì)胞數(shù)

　　4）規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

　　5)用途：僅供科研使用。

　　運輸和保存

　　干冰運輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞

　　（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

　?。?）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

　　細(xì)胞接收后的處理

　　1）收到細(xì)胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請拍照后及時聯(lián)系我們。

　　2）請在4或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

　　3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若鏡下觀察細(xì)胞的生長密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的完全培養(yǎng)基6-8mL，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞生長密度達(dá)70%-80%以上，可以對細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細(xì)胞需要離心回收。

　　4）備注：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。收到細(xì)胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代。

　　一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

　　1）準(zhǔn)備DMEM(（含NaHCO3 1.5g/L，推薦：北京百歐博偉生物技術(shù)專用培養(yǎng)基或者GIBCO,貨號12800017，添加NaHCO3 1.5g/L）培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清10%;P/S 1%

　　2）傳代比例：1:3-1:4接種密度2萬-4萬活細(xì)胞/平方厘米，維持密度10萬-20萬活細(xì)胞/平方厘米。換液頻率：每周2次

　　注意事項：

　　a)該細(xì)胞長得較慢，復(fù)蘇和傳代后有時需要48小時貼壁。通常長到50%融合度需要2周或更長時間，并且有時會出現(xiàn)漂浮的細(xì)胞團(tuán)塊和細(xì)胞碎片，這都是正常的。請按照我們推薦的接種密度傳代。最好用T25培養(yǎng)瓶。

　　b)該細(xì)胞貼壁后呈現(xiàn)許多小的緊密連接的細(xì)胞團(tuán)以及單細(xì)胞。如果傳代或換液時有許多漂浮的細(xì)胞，請收集并離心，這些細(xì)胞可以繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞維持請參照我們推薦的細(xì)胞密度。

　　C)該細(xì)胞在DMEM(含1.5g/LNaHCO3)培養(yǎng)基中生長良好，大部分品牌的DMEM含有較高濃度的NaHCO3（3.7g/L），若使用DMEM（3.7g/L NaHCO3）培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞時需要提高CO2濃度（7%-10%）。

　　2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

　　3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

　　二．細(xì)胞處理：

　　1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：

　　將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。

　　2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)70%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

　　該細(xì)胞輕微貼壁和懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，傳代可以參考以下方法：

　　1.收集：將培養(yǎng)瓶中的懸浮的細(xì)胞收集到離心管中。用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。由于細(xì)胞貼壁不牢PBS潤洗后細(xì)胞會脫落所以PBS也要回收到離心管中。

　　2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

　　3.將收集到的懸浮細(xì)胞、pbs清洗液中的細(xì)胞和消化下來的貼壁細(xì)胞以1000rpml離心5min，棄去上清，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后重懸混勻后將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

　　3）細(xì)胞凍存:收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實驗使用。

　　下面T25瓶為例；

　　1.細(xì)胞凍存時按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計數(shù)板計數(shù)，來決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個活細(xì)胞/ml.

　　2.1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，按每1ml凍存液含1×106~1×107個活細(xì)胞/ml分配到一個凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

　　將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。