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細(xì)胞CELL>
biobw自建細(xì)胞系>
人陰道上皮細(xì)胞細(xì)胞介紹
VK2/E6E7 是一種上皮細(xì)胞系,于 1996 年從一位因子宮內(nèi)膜異位癥而接受子宮切除術(shù)的 32 歲女性患者的粘膜中分離出來。
細(xì)胞特性
1) 來源: 32 歲女性患者的陰道粘膜
2) 形態(tài):上皮細(xì)胞樣,貼壁生長
3) 含量:>1x10^6 細(xì)胞數(shù)
4) 規(guī)格:T25瓶或者1mL凍存管包裝
5) 用途:僅供科研使用。
運(yùn)輸和保存
干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞
(1)1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸,收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇,若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染,請立即與我們聯(lián)系。
(2)T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨,收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。
細(xì)胞接收后的處理
1)收到細(xì)胞后,75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h,若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染,請拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。
2)請?jiān)?或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài),同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照(10×,20×)各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存,作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。
3)貼壁細(xì)胞:細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h,顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長和貼壁情況,有些貼壁細(xì)胞在快遞運(yùn)送過程中會因振動脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若鏡下觀察細(xì)胞的生長密度若在60%以下,可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基(若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收,重懸打入到原培養(yǎng)瓶中),加入新配制的完全培養(yǎng)基6-8mL,放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞生長密度達(dá)70%-80%以上,可以對細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過程中,若因運(yùn)輸振動脫落的細(xì)胞需要離心回收。
4)備注:運(yùn)輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞,請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。 收到細(xì)胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1:2傳代 。
一.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備
1)準(zhǔn)備 角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基 (包含兩個(gè)組份:基礎(chǔ)培養(yǎng)基1瓶+生長因子1管:1mL或者5mL兩種)添加對應(yīng)因子按照收到的生長因子對應(yīng)規(guī)格:1mL加0.2%, 5mL 加1%,同時(shí)添加1% P/S 來培養(yǎng)細(xì)胞?;蛘?準(zhǔn)備Defined K-SFM (part of kit NO:,10744-019) 來培養(yǎng)細(xì)胞。
備注:
1. Defined K-SFM (part of kit NO:,10744-019)培養(yǎng)液包含兩個(gè)組份:基礎(chǔ)培養(yǎng)基1瓶500mL+生長因子1管1mL
2. 該細(xì)胞生長依賴于人表皮生長因子EGF,故而生長不能過密,請?jiān)谌诤隙冗_(dá)到80%時(shí)進(jìn)行傳代。
4.使用0.05%胰酶消化細(xì)胞,由于角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基或者Defined K-SFM為無血清培養(yǎng)液無法終止胰酶消化,所以消化完成后要通過離心(建議125xg離心5到10分鐘)(或者加入加入3-4ml用RPMI1640或者DMEM等基礎(chǔ)培養(yǎng)基配置的含10%FBS)的培養(yǎng)基來終止消化,1000rpm/5min,去除胰酶后再加入細(xì)胞完全培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
5.Defined K-SFM是一種無血清培養(yǎng)基,添加生長因子后請不要過濾。在無血清培養(yǎng)體系中,細(xì)胞生長緩慢并且需要一些時(shí)間才能貼壁,可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求酌情添加1%FBS來進(jìn)行培養(yǎng)。
2)培養(yǎng)條件: 氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。 溫度:37℃,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3)凍存液:完全培養(yǎng)液92.5%,7.5%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配。
4)傳代比例:如果沒有特別說明,收到細(xì)胞后的第一次傳代一般是1:2。傳代周期:4-6天,換液頻率:每周 2-3次。
二.細(xì)胞處理
1) 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min,棄去上清液,完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶(或皿)中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。
2) 細(xì)胞傳代:如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法
1. 棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2. 加入0.05%胰蛋白酶于培養(yǎng)瓶中(T25瓶1-2mL,T75瓶2-3mL),置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘左右,然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。
3.輕輕打勻后吸出,在1000RPM條件下離心3-5min,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1:2的比例分到新T25瓶中,添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力,后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。
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