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 ● 制品說明pMD19-T Vector 是一種高效克隆 PCR 產(chǎn)物（TA Cloning）的專用載體。本載體由 pUC19 載體改建而成，在pUC19 載體的多克隆位點(diǎn)處的XbaI 和SalI 識別位點(diǎn)之間插入了EcoR V 識別位點(diǎn)，用EcoR V 進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3’端添加“T”而成。因大部分耐熱性 DNA 聚合酶進(jìn)行 PCR 反應(yīng)時(shí)都有在 PCR產(chǎn)物的3’末端添加一個(gè)“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高 PCR 產(chǎn)物的連接、克隆效率。由于本載體以pUC19 載體為基礎(chǔ)構(gòu)建而成，所以它具有同 pUC19 載體相同的功能。此外，本制品中的高效連接液Solution I 可以在短時(shí)間內(nèi)（約 30 分鐘）完成連接反應(yīng)，其連接液可以直接用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化，大大方便了實(shí)驗(yàn)操作。本制品中的Control Insert（500 bp）還可以用于 Control 反應(yīng)。本載體與pMD18-T Vector 相比，本制品的β-半乳糖苷酶的表達(dá)活性更高，菌落顯示藍(lán)色的時(shí)間縮短，菌落顯示的藍(lán)色更深。因此，克隆后更容易進(jìn)行克隆體的藍(lán)白篩選?！?nbsp;制品內(nèi)容（20 次量） pMD19-T Vector（50 ng/μl）20 μl×1 支Control Insert（50 ng/μl）10 μl×1 支Solution I*75 μl×2 支* 使用時(shí)請于冰中融解?！?nbsp;保 存：-20℃● 純 度■ Control Insert 經(jīng)克隆后的白色菌落中，有 90%以上含有 Insert DNA 片段。● 用 途■ 進(jìn)行 TA 克隆，克隆 PCR 產(chǎn)物?！?nbsp;對克隆后的 PCR 產(chǎn)物使用BcaBEST Sequencing Primers、M13 Primers 進(jìn)行 DNA 測序?！?nbsp;pMD19-T Vector 的結(jié)構(gòu) ● 實(shí)驗(yàn)操作■ Control DNA 片段的克隆實(shí)驗(yàn)A） 操作方法1） 在微量離心管中配制下列 DNA 溶液，全量為 5 μl。試劑使用量pMD19-T Vector*11 μlControl Insert*21 μl滅菌水3 μl2） 加入 5 μl（等量）的 Solution I。3） 16℃反應(yīng) 30 分鐘。注）① 室溫（25℃）也能正常進(jìn)行連接反應(yīng)，但反應(yīng)效率稍微降低。② 5 分鐘也能正常進(jìn)行連接反應(yīng)，但反應(yīng)效率稍微降低。4） 全量（10 μl）加入至 100 μl JM109 感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置 30 分鐘。5） 42℃加熱 45 秒鐘后，再在冰中放置 1 分鐘。6） 加入 890 μl SOC 培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng) 60 分鐘。7） 在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。計(jì)數(shù)白色、藍(lán)色菌落。8） 挑選白色菌落，使用 PCR 法確認(rèn)載體中插入片段的長度大小?！?nbsp;一般 DNA 片段的克隆實(shí)驗(yàn)1）在微量離心管中配制下列DNA 溶液，全量為 5 μl。試劑使用量pMD19-T Vector*11 μlInsert DNA*30.1 pmol～0.3 pmol滅菌水up to 5 μl-3-2） 加入 5 μl（等量）的 Solution I。3）16℃反應(yīng) 30 分鐘。注）① 室溫（25℃）也能正常進(jìn)行連接反應(yīng)，但反應(yīng)效率稍微降低。② 5 分鐘也能正常進(jìn)行連接反應(yīng)，但反應(yīng)效率稍微降低。③ 長片段 PCR 產(chǎn)物（2 kb 以上）進(jìn)行 DNA 克隆時(shí)，連接反應(yīng)時(shí)間請延長至數(shù)小時(shí)。4） 全量（10 μl）加入至 100 μl JM109 感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置 30 分鐘。5） 42℃加熱 45 秒鐘后，再在冰中放置 1 分鐘。6） 加入 890 μl SOC 培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng) 60 分鐘。7） 在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。計(jì)數(shù)白色、藍(lán)色菌落。8） 挑選白色菌落，使用 PCR 法確認(rèn)載體中插入片段的長度大小。■ 一種可供選擇的快速克隆法*41） 在微量離心管中配制下列 DNA 溶液，全量為 5 μl。試劑使用量pMD19-T Vector*11 μlInsert DNA*30.1 pmol～0.3 pmol滅菌水up to 5 μl2） 加入 5 μl（等量）的 Solution I。3） 16℃反應(yīng) 30 分鐘。注）① 室溫（25℃）也能正常進(jìn)行連接反應(yīng)，但反應(yīng)效率稍微降低。② 5 分鐘也能正常進(jìn)行連接反應(yīng)，但反應(yīng)效率稍微降低。③ 長片段 PCR 產(chǎn)物（2 kb 以上）進(jìn)行 DNA 克隆時(shí)，連接反應(yīng)時(shí)間請延長至數(shù)小時(shí)。4） 取 2 μl 上述連接液（10 ng Vector DNA）加入到 microcentrifuge tubes 中，冰上冷卻 2 min。5） 取 50 μlE.coliJM109 Competent Cell 加入到上述 microcentrifuge tubes 中，混勻并冰浴 5 min。6） 在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)（平板使用前需要在 37℃預(yù)熱 30 分鐘），形成單菌落。計(jì)數(shù)白色、藍(lán)色菌落。*1pMD19-T Vector 的使用量取0.5 μl 實(shí)驗(yàn)也可得到滿意的結(jié)果。實(shí)際操作時(shí)，可按實(shí)驗(yàn)需要確定 T 載體的使用量。pMD19-TVector 1 μl（50 ng）的摩爾數(shù)約為 0.03 pmol。*2Control InsertControl Insert 為 500 bp 的 3′ 末端帶有 A 堿基的 PCR 產(chǎn)物，Control Insert 1 μl（50 ng）的摩爾數(shù)約為0.15 pmol。*3Insert DNA 的使用量在進(jìn)行克隆時(shí)，Vector DNA 和 Insert DNA 的摩爾比一般為：1：2～10。*4 快速克隆法該克隆方法的效率會有所下降，但此方法操作簡單、迅速，是一快速克隆DNA 片段的方法，可以滿足一定客戶的需求。-4-● 相關(guān)說明1.感受態(tài)細(xì)胞的選擇。轉(zhuǎn)化時(shí)請使用高效的熱轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（轉(zhuǎn)化效率≥1×108cfu/μg pUC19），這樣才可能得到比較理想的陽性克隆。如果需要進(jìn)行藍(lán)白篩選時(shí)，宿主細(xì)胞必須具有正確的基因型（F’編碼的［LacZ△M15］）產(chǎn)生ω Fragment，才可能和載體 DNA 產(chǎn)生的LacZα多肽相結(jié)合，表現(xiàn)出β-半乳糖苷酶活性（α-互補(bǔ)性）。2.Insert DNA 的要求。Insert DNA 應(yīng)該進(jìn)行切膠回收的純化處理后才進(jìn)行載體連接，盡量避免引物等其它雜質(zhì)的存在。切膠回收時(shí)可使用Takara 凝膠回收試劑盒（Code No. 9762）。3.Insert DNA 使用量的計(jì)算方法。進(jìn)行克隆時(shí)，Vector DNA 和 Insert DNA 的摩爾數(shù)比一般為 1：2～10，我們可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)情況選擇合適的Vector DNA 和 Insert DNA 的摩爾數(shù)比。Insert DNA 使用量的計(jì)算方法如下：Insert DNA 的使用量（ng）=nmol 數(shù)×660×Insert DNA 的 bp 數(shù)本載體1 μl（50 ng）的摩爾數(shù)約為 0.03 pmol。4.陽性克隆的檢測。DNA 片段成功插入至 pMD19-T Vector 中后，一般情況下β-半乳糖苷酶的表達(dá)將受到破壞，重組克隆體在含有X-Gal、IPTG、Amp 的 L-瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)將顯示白色菌落。但有時(shí)比較短的 DNA片段插入載體時(shí)，基因的讀碼框有可能正好與LacZ的讀碼框相吻合，克隆體也會顯示藍(lán)色菌落。有報(bào)道稱，2 kb 的 DNA 片段插入到載體中后，重組克隆體仍顯示了藍(lán)色。所以，當(dāng)我們沒有得到白色菌落時(shí)，可以試著檢測藍(lán)色菌落。進(jìn)行陽性克隆檢測時(shí)，我們建議使用PCR 的方法，擴(kuò)增用引物可以使用BcaBEST Sequencing Primers，可以對菌體直接進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。5.陽性對照實(shí)驗(yàn)。為了確認(rèn)實(shí)驗(yàn)操作的正確性以及實(shí)驗(yàn)試劑的有效性，我們建議進(jìn)行陽性對照實(shí)驗(yàn)。按照實(shí)驗(yàn)操作方法，使用試劑盒中提供的Control Insert，可以進(jìn)行 10 次陽性對照實(shí)驗(yàn)。6.轉(zhuǎn)化效率的計(jì)算。取0.1 ng 的 pUC19 Plasmid DNA 加入至 100 μl 的熱轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中后，再加入 900 μl 的 SOC培養(yǎng)基（0.1 ng DNA/ml），將上述培養(yǎng)液稀釋 10 倍后（0.01 ng DNA/ml）取 100 μl 涂布平板（0.001ng DNA/100 μl），記錄菌落數(shù)。以得到 200 個(gè)克隆體為例計(jì)算轉(zhuǎn)化效率，此時(shí)的轉(zhuǎn)化效率=200cfu/0.001 ng=2×105cfu=2×108cfu/μg pUC19 DNA?！?nbsp;使用注意1.Solution I 請于冰中融解。2.克隆時(shí)使用的Insert DNA 片段（PCR 產(chǎn)物）建議進(jìn)行切膠回收純化，否則 PCR 產(chǎn)物中的短片段DNA（甚至是電泳也無法確認(rèn)的非特異性小片段）、殘存引物等雜質(zhì)都會影響 TA 克隆效率。3.按照本實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行連接后，直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)的連接液不要超過20 μl。當(dāng)要轉(zhuǎn)化的 DNA 量較大或準(zhǔn)備進(jìn)行電轉(zhuǎn)化時(shí)，需對連接液進(jìn)行乙醇沉淀，純化DNA 后再進(jìn)行轉(zhuǎn)化。進(jìn)行乙醇沉淀時(shí)使用 Dr. GenTLEPrecipitation Carrier（Code No. 9094）可以提高 DNA 的回收率。4.連接反應(yīng)請?jiān)?5℃以下進(jìn)行，溫度升高（>26℃）較難形成環(huán)狀 DNA。連接效率偏低時(shí)，可適當(dāng)延長連接反應(yīng)時(shí)間至數(shù)小時(shí)。5.本制品來源于pUC19 載體，因此，適合 pUC19 載體的感受態(tài)細(xì)胞都可以使用，如：JM109 等。-5-● Q&AQ-1 怎樣提高連接轉(zhuǎn)化效率？A-1 1. 確認(rèn) Insert DNA 片段的 3’末端是否帶有“A”尾。大部分的高保真 DNA 聚合酶（如: TakaraPyrobest、KOD、Pfx、Pfu等）擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物是平滑末端，不能直接進(jìn)行 TA 克隆。2. 純化 PCR 產(chǎn)物。建議使用切膠回收的 PCR 片段，以除去 PCR 產(chǎn)物中的非特異性片段和引物等雜質(zhì)。進(jìn)行切膠回收時(shí)可以使用Takara 凝膠回收試劑盒（Code No. 9762）。3. 請使用轉(zhuǎn)化效率大于 108cfu/μg pUC19 DNA 的感受態(tài)細(xì)胞。4. DNA 片段的立體結(jié)構(gòu)、DNA 片段的長短都會影響克隆效率。一般情況下，大片段 DNA 的克隆效率（連接效率與轉(zhuǎn)化效率）偏低，此時(shí)可以延長連接反應(yīng)時(shí)間，或采用電轉(zhuǎn)化方法。5. 進(jìn)行切膠回收純化 DNA 片段時(shí)，不要使 DNA 片段在紫外線下暴露時(shí)間過長。6. Solution I 應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融。7. 建議使用新配制的平板培養(yǎng)基。Q-2 轉(zhuǎn)化后的菌落全為藍(lán)色，但有目的 DNA 片段的插入，為什么？A-2插入的 DNA 片段較短（小于 500 bp），且插入片段沒有影響LacZ 基因的讀框，此時(shí)平板培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落有可能呈現(xiàn)藍(lán)色（或淡藍(lán)色）。Q-3 欲對克隆 DNA 片段進(jìn)行測序時(shí)，使用何種引物？A-3 本載體來源于 pUC19 載體。因此，用于 pUC19 載體測序的通用引物都可以使用。Q-4 pMD19-T Vector 與 pMD18-T Vector 相比有何不同？A-4 pMD19-T Vector 與 pMD18-T Vector 相比，β-半乳糖苷酶的表達(dá)活性更高，菌落顯示藍(lán)色的時(shí)間縮短，菌落顯示的藍(lán)色更深。pMD18-T Vector 連接轉(zhuǎn)化后，一般要經(jīng) 37℃過夜培養(yǎng)，然后再將其于冰箱內(nèi)放置一段時(shí)間后，其藍(lán)白菌落才能明顯呈色。而pMD19-T Vector 涂板培養(yǎng)后一般只需 10 個(gè)小時(shí)（37℃）便可以呈色。因此，pMD19-T Vector 比 pMD18-T Vector 更適合于藍(lán)白菌落的篩選。